В основе коллекции Национальной пинакотеки лежит собрание аббата Джузеппе Чаккери, которые он начал собирать в конце 18 столетия. Впоследствии оно обогатилось работами, принесенными в дар представителями знатных фамилий Сиены. Сейчас коллекция пинакотеки включает произведения сиенской живописной школы 13-17 веков. С 1977 года пинакотеке перешла коллекция Спаннокки, состоящая из произведений североитальянских, фламандских, немецких и голландских мастеров.